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兽医公共卫生概论实验报告
任选两个实验，按实验的具体要求，提交实验报告
《兽医公共卫生概论》实验报告（二）
实验十 空气中微生物的测定
一、实验目的
通过对空气中细菌总数、真菌总数、β-溶血性链球菌和嗜肺军团菌的测定，可以评估周围环境的质量状况，从而采取有效措施来改善环境质量；可以及时发现并控制疾病的传播途径，从而有效地预防疾病的传播；可以为公共卫生管理部门提供科学依据，从而有针对性制定更加有效的公共卫生管理措施。
二、实验器材
用于测定细菌总数的材料与仪器
（1）六级筛孔撞击式微生物采样器
（2）高压蒸汽灭菌器
（3）恒温培养箱
（4）采样支架
（5）平皿：φ90mm
（6）营养琼脂培养基（蛋白胨10g、氯化钠5g、肉膏5g、琼脂20g、蒸馏水1000mL）：将蛋白胨、氯化钠、肉膏于蒸馏水中，校正pH为7.2～7.6，加人琼脂，121℃，20min灭菌备用。
用于测定真菌总数的材料与仪器
（1）六级筛孔撞击式微生物采样器
（2）高压蒸汽灭菌器
（3）恒温培养箱
（4）采样支架
（5）平皿：φ90mm
（6）沙氏琼脂培养基（蛋白胨10g、葡萄糖40g、琼脂20g、蒸馏水1000mL）：将蛋白胨、葡萄糖溶于蒸馏水中，校正pH为5.5～6.0，加入琼脂，115℃，15min灭菌备用。
用于测定β-溶血性链球菌的材料与仪器
（1）六级筛孔撞击式微生物采样器
（2）高压蒸汽灭菌器
（3）恒温培养箱
（4）平皿：φ90mm
（5）血琼脂平板（蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g、脱纤维羊血5mL～10mL、蒸馏水1000 mL）：将蛋白胨、氯化钠加热溶化于蒸馏水中，校正pH为7.4～7.6，加人琼脂，121℃，20 min 灭菌。待冷却至50℃左右，以无菌操作加入脱纤维羊血，摇匀倾皿。
4.用于测定嗜肺军团菌的材料与仪器
（1）微生物气溶胶浓缩器：采样流量≥100L/min，对于直径3.0μm以上粒子的捕集效率应≥80%(或浓缩比≥8)。
（2）液体冲击式微生物气溶胶采样器：采样流量7L/min～15L/min,对于0.5μm以上粒子的捕集效率应≥90%。
（3）离心管：容积50mL。
（4）平皿：φ90mm。
（5）CO2培养箱：35℃～37℃。
（6）紫外灯：波长360nm±2nm。
（7）涡旋振荡器。
（8）普通光学显微镜、荧光显微镜。
（9）水浴箱。
（10）采样吸收液1—GVPC液体培养基
①GVPC添加剂成分（多黏菌素B硫酸盐10mg、万古霉素0.5mg、放线菌酮80mg）
②BCYE添加剂成分（α-酮戊二酸1.0g、N-2酰胺基-2胺基乙烷磺酸（ACES）10.0g、氢氧化钾2.88g、L-半胱氨酸盐酸盐0.4g、焦磷酸铁0.25g）
③吸收液成分（活性炭2g、酵母浸出粉10g、GVPC添加剂、BCYE添加剂、蒸馏水1000mL）
④将活性炭、酵母浸出粉加水至1000mL，121℃下高压灭菌15min，加人GVPC添加剂和BCYE添加剂，分装于灭菌后的50mL离心管中备用。
（11）采样吸收液2—酵母提取液
①吸收液成分（酵母浸出粉12g、蒸馏水1000mL）
②将酵母浸出粉加水至1000mL，121℃下高压灭菌15min，分装于灭菌后的50mL离心管中备用。
（12）盐酸氯化钾溶液[c(HC1·KC1)=0.01mol/L]
①成分：盐酸(0.2mol/L)3.9mL、氯化钾(0.2mol/L) 25mL
②制法：将上述成分混合，用1mol/L氢氧化钾调整pH=2.2±0.2，121℃下高压灭菌15min备用。
（13）GVPC琼脂平板。
（14）BCYE琼脂平板。
（15）BCYE-CYE（BCYE无L-半胱氨酸）琼脂平板。
（16）革兰氏染色液。
（17）马尿酸盐生化反应管。
（18）军团菌分型血清试剂。
三、实验步骤
撞击法采样布点要求
①室内面积不足50m2的设置1个采样点，50m2～200m2的设置2个采样点，200m2以上的设置3个～5个采样点。
②采样点按均匀布点原则布置，室内1个采样点的设置在中央，2个采样点的设置在室内对称点上，3个采样点的设置在室内对角线四等分的3个等分点上，5个采样点的按梅花布点，其他的按均匀布点原则布置。
③采样点距离地面高度1.2m～1.5m，距离墙壁不小于1m。
④采样点应避开通风口、通风道等。
自然沉降法采样布点要求
①室内面积不足50m2的设置3个采样点，50m2以上的设置5个采样点。
②采样点按均匀布点原则布置，室内3个采样点的设置在室内对角线四等分的3个等分点上，5 个采样点的按梅花布点。
③采样点距离地面高度1.2m～1.5m，距离墙壁不小于1m。
④采样点应避开通风口、通风道等。
细菌总数的测定
（1）原理
采用撞击法或自然沉降法采样、营养琼脂培养基培养计数的方法测定公共场所空气中的细菌总数。
（2）撞击法
1）采样
①采样点：参照撞击法采样布点要求。
②采样环境条件：采样时关闭门窗15min～30min，记录室内人员数量、温湿度与天气状况等。
③采样方法：以无菌操作，使用撞击式微生物采样器以28.3L/min流量采集5min～15min。
采样器使用按照说明书要求进行。
2）检验步骤：将采集细菌后的营养琼脂平皿置35℃～37℃培养48h，菌落计数。
3）结果报告：采样点细菌总数计算，记录结果并按稀释比与采气体积换算成CFU/m3(每立方米空气中菌落形成单位)。
（3）自然沉降法
1）采样
①采样点：自然沉降法采样布点要求。
②采样环境条件：采样时关闭门窗15min～30min，记录室内人员数量、温湿度与天气状况等。
③采样方法：将营养琼脂平板置于采样点处，打开皿盖，暴露5min。
2）检验步骤：将采集细菌后的营养琼脂平皿置35℃～37℃培养48h，菌落计数。
3）结果报告：计数每块平板上生长的菌落数，求出全部采样点的平均菌落数，检验结果以每平皿菌落数(CFU/皿)给出。
真菌总数的测定
（1）原理
采用撞击法或自然沉降法采样、沙氏琼脂培养基培养计数的方法测定公共场所空气中的真菌总数。
（2）撞击法
1）采样
同细菌总数的撞击法采样。
2）检验步骤：将采集真菌后的沙氏琼脂培养基半皿置28℃培养，逐日观察并于第5天记录结果。若真菌数量过多可于第3天计数结果，并记录培养时间。
3）结果报告：采样点真菌总数结果计算：菌落计数，记录结果并按稀释比与采气体积换算成CFU/m3(每立方米空气中菌落形成单位)。
（3）自然沉降法
1）采样
同细菌总数的自然沉降法采样。
2）检验步骤：将采集真菌后的沙氏琼脂培养基半皿置28℃培养，逐日观察并于第5天记录结果。若真菌数量过多可于第3天计数结果，并记录培养时间。
3）结果报告：计数每块平板上生长的菌落数，求出全部采样点的平均菌落数，检验结果以每平皿菌落数(CFU/皿)给出。
β-溶血性链球菌的测定
（1）原理
采用撞击法采样、血琼脂培养基培养计数的方法测定公共场所空气中的β-溶血性链球菌。
（2）撞击法
1）采样
同细菌总数的撞击法采样。
2）检验步骤
①培养方法：采样后的血琼脂平板在35℃～37℃下培养24h～48h。
②结果观察：培养后，在血琼脂平板上形成呈灰白色、表面突起、直径0.5mm～0.7mm的细小菌落，菌落透明或半透明，表面光滑有乳光；镜检为革兰氏阳性无芽孢球菌，圆形或卵圆形，呈链状排列，受培养与操作条件影响，链的长度在4个～8个细胞至几十个细胞之间；菌落周围有明显的2mm～4mm界限分明、完全透明的无色溶血环。符合上述特征的菌落为β-溶血性链球菌。
3）结果报告：采样点β-溶血性链球菌结果计算：菌落计数，记录结果并按稀释比与采气体积换算成 CFU/m3(每立方米空气中菌落形成单位)。
嗜肺军团菌的测定
（1）原理
采用液体冲击法采样、培养法定性测定公共场所空气中的嗜肺军团菌。
（2）液体冲击法
1）采样
①采样点：参照撞击法采样布点要求。
②将采样吸收液120mL倒人微生物气溶胶采样器中，然后用吸管加人矿物油1滴～2滴。
③将微生物气溶胶浓缩器与微生物气溶胶采样器连接，按照微生物气溶胶浓缩器和微生物气溶胶采样器的流量要求调整主流量和浓缩流量。
④按浓缩器和采样器说明书操作，每个气溶胶样品采集空气量1m3～2m3。
⑤将采样吸收液220mL倒人微生物气溶胶采样器中，然后用吸管加入矿物油1滴～2滴；在相同采样点重复③、④步骤。
⑥采集的样品不必冷冻，但要避光和防止受热，4h内送实验室检验。
2）检验步骤
①样品的酸处理：对采样后的吸收液1和吸收液2原液各取1mL，分别加入盐酸氯化钾溶液充分混合，调pH至2.2，静置15min。
②样品的接种：在酸处理后的两种样品中分别加入1mol/L氢氧化钾溶液，中和至pH为6.9，各取悬液0.2mL～0.3mL分别接种GVPC平板。
③样品的培养：将接种平板静置于浓度为5%、温度为35℃～37℃的CO2培养箱中，孵育10 d。
④菌落观察：从孵育第3天开始观察菌落。军团菌的菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色；菌落齐，表面光滑，呈典型毛玻璃状，在紫外灯下，部分菌落有荧光。
⑤菌落验证：从平皿上挑取2个可疑菌落，接种BCYE琼脂平板和L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板，35℃～37℃培养2d，凡在BCYE琼脂平板上生长而在L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板不生长的则为军团菌菌落。
⑥菌型确定：应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌。生化培养：氧化酶(-/弱+),硝酸盐还原(-),尿素酶(-),明胶液化(+)，水解马尿酸。血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型。
3）结果报告：采样点测定结果：两种采样吸收液中至少有一种吸收液培养出嗜肺军团菌，即为该采样点嗜肺军团菌阳性。一个区域中任意一个采样点嗜肺军团菌阳性，即该区域空气中嗜肺军团菌的测定结果为阳性。
四、实验报告
撰写实验报告，通过对空气中微生物的测定，可以了解环境中微生物的种类、数量及其分布情况，评估空气质量和卫生状况，为环境监测和卫生管理提供参考依据。另外，通过定期对空气中微生物进行监测，有助于及时发现和控制潜在的病原微生物污染，保障人们的健康和安全。

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兽医公共卫生概论实验报告
任选两个实验，按实验的具体要求，提交实验报告
《兽医公共卫生概论》实验报告（二）
实验十 空气中微生物的测定
一、实验目的
通过对空气中细菌总数、真菌总数、β-溶血性链球菌和嗜肺军团菌的测定，可以评估周围环境的质量状况，从而采取有效措施来改善环境质量；可以及时发现并控制疾病的传播途径，从而有效地预防疾病的传播；可以为公共卫生管理部门提供科学依据，从而有针对性制定更加有效的公共卫生管理措施。
二、实验器材
用于测定细菌总数的材料与仪器
（1）六级筛孔撞击式微生物采样器
（2）高压蒸汽灭菌器
（3）恒温培养箱
（4）采样支架
（5）平皿：φ90mm
（6）营养琼脂培养基（蛋白胨10g、氯化钠5g、肉膏5g、琼脂20g、蒸馏水1000mL）：将蛋白胨、氯化钠、肉膏于蒸馏水中，校正pH为7.2～7.6，加人琼脂，121℃，20min灭菌备用。
用于测定真菌总数的材料与仪器
（1）六级筛孔撞击式微生物采样器
（2）高压蒸汽灭菌器
（3）恒温培养箱
（4）采样支架
（5）平皿：φ90mm
（6）沙氏琼脂培养基（蛋白胨10g、葡萄糖40g、琼脂20g、蒸馏水1000mL）：将蛋白胨、葡萄糖溶于蒸馏水中，校正pH为5.5～6.0，加入琼脂，115℃，15min灭菌备用。
用于测定β-溶血性链球菌的材料与仪器
（1）六级筛孔撞击式微生物采样器
（2）高压蒸汽灭菌器
（3）恒温培养箱
（4）平皿：φ90mm
（5）血琼脂平板（蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g、脱纤维羊血5mL～10mL、蒸馏水1000 mL）：将蛋白胨、氯化钠加热溶化于蒸馏水中，校正pH为7.4～7.6，加人琼脂，121℃，20 min 灭菌。待冷却至50℃左右，以无菌操作加入脱纤维羊血，摇匀倾皿。
4.用于测定嗜肺军团菌的材料与仪器
（1）微生物气溶胶浓缩器：采样流量≥100L/min，对于直径3.0μm以上粒子的捕集效率应≥80%(或浓缩比≥8)。
（2）液体冲击式微生物气溶胶采样器：采样流量7L/min～15L/min,对于0.5μm以上粒子的捕集效率应≥90%。
（3）离心管：容积50mL。
（4）平皿：φ90mm。
（5）CO2培养箱：35℃～37℃。
（6）紫外灯：波长360nm±2nm。
（7）涡旋振荡器。
（8）普通光学显微镜、荧光显微镜。
（9）水浴箱。
（10）采样吸收液1—GVPC液体培养基
①GVPC添加剂成分（多黏菌素B硫酸盐10mg、万古霉素0.5mg、放线菌酮80mg）
②BCYE添加剂成分（α-酮戊二酸1.0g、N-2酰胺基-2胺基乙烷磺酸（ACES）10.0g、氢氧化钾2.88g、L-半胱氨酸盐酸盐0.4g、焦磷酸铁0.25g）
③吸收液成分（活性炭2g、酵母浸出粉10g、GVPC添加剂、BCYE添加剂、蒸馏水1000mL）
④将活性炭、酵母浸出粉加水至1000mL，121℃下高压灭菌15min，加人GVPC添加剂和BCYE添加剂，分装于灭菌后的50mL离心管中备用。
（11）采样吸收液2—酵母提取液
①吸收液成分（酵母浸出粉12g、蒸馏水1000mL）
②将酵母浸出粉加水至1000mL，121℃下高压灭菌15min，分装于灭菌后的50mL离心管中备用。
（12）盐酸氯化钾溶液[c(HC1·KC1)=0.01mol/L]
①成分：盐酸(0.2mol/L)3.9mL、氯化钾(0.2mol/L) 25mL
②制法：将上述成分混合，用1mol/L氢氧化钾调整pH=2.2±0.2，121℃下高压灭菌15min备用。
（13）GVPC琼脂平板。
（14）BCYE琼脂平板。
（15）BCYE-CYE（BCYE无L-半胱氨酸）琼脂平板。
（16）革兰氏染色液。
（17）马尿酸盐生化反应管。
（18）军团菌分型血清试剂。
三、实验步骤
撞击法采样布点要求
①室内面积不足50m2的设置1个采样点，50m2～200m2的设置2个采样点，200m2以上的设置3个～5个采样点。
②采样点按均匀布点原则布置，室内1个采样点的设置在中央，2个采样点的设置在室内对称点上，3个采样点的设置在室内对角线四等分的3个等分点上，5个采样点的按梅花布点，其他的按均匀布点原则布置。
③采样点距离地面高度1.2m～1.5m，距离墙壁不小于1m。
④采样点应避开通风口、通风道等。
自然沉降法采样布点要求
①室内面积不足50m2的设置3个采样点，50m2以上的设置5个采样点。
②采样点按均匀布点原则布置，室内3个采样点的设置在室内对角线四等分的3个等分点上，5 个采样点的按梅花布点。
③采样点距离地面高度1.2m～1.5m，距离墙壁不小于1m。
④采样点应避开通风口、通风道等。
细菌总数的测定
（1）原理
采用撞击法或自然沉降法采样、营养琼脂培养基培养计数的方法测定公共场所空气中的细菌总数。
（2）撞击法
1）采样
①采样点：参照撞击法采样布点要求。
②采样环境条件：采样时关闭门窗15min～30min，记录室内人员数量、温湿度与天气状况等。
③采样方法：以无菌操作，使用撞击式微生物采样器以28.3L/min流量采集5min～15min。
采样器使用按照说明书要求进行。
2）检验步骤：将采集细菌后的营养琼脂平皿置35℃～37℃培养48h，菌落计数。
3）结果报告：采样点细菌总数计算，记录结果并按稀释比与采气体积换算成CFU/m3(每立方米空气中菌落形成单位)。
（3）自然沉降法
1）采样
①采样点：自然沉降法采样布点要求。
②采样环境条件：采样时关闭门窗15min～30min，记录室内人员数量、温湿度与天气状况等。
③采样方法：将营养琼脂平板置于采样点处，打开皿盖，暴露5min。
2）检验步骤：将采集细菌后的营养琼脂平皿置35℃～37℃培养48h，菌落计数。
3）结果报告：计数每块平板上生长的菌落数，求出全部采样点的平均菌落数，检验结果以每平皿菌落数(CFU/皿)给出。
真菌总数的测定
（1）原理
采用撞击法或自然沉降法采样、沙氏琼脂培养基培养计数的方法测定公共场所空气中的真菌总数。
（2）撞击法
1）采样
同细菌总数的撞击法采样。
2）检验步骤：将采集真菌后的沙氏琼脂培养基半皿置28℃培养，逐日观察并于第5天记录结果。若真菌数量过多可于第3天计数结果，并记录培养时间。
3）结果报告：采样点真菌总数结果计算：菌落计数，记录结果并按稀释比与采气体积换算成CFU/m3(每立方米空气中菌落形成单位)。
（3）自然沉降法
1）采样
同细菌总数的自然沉降法采样。
2）检验步骤：将采集真菌后的沙氏琼脂培养基半皿置28℃培养，逐日观察并于第5天记录结果。若真菌数量过多可于第3天计数结果，并记录培养时间。
3）结果报告：计数每块平板上生长的菌落数，求出全部采样点的平均菌落数，检验结果以每平皿菌落数(CFU/皿)给出。
β-溶血性链球菌的测定
（1）原理
采用撞击法采样、血琼脂培养基培养计数的方法测定公共场所空气中的β-溶血性链球菌。
（2）撞击法
1）采样
同细菌总数的撞击法采样。
2）检验步骤
①培养方法：采样后的血琼脂平板在35℃～37℃下培养24h～48h。
②结果观察：培养后，在血琼脂平板上形成呈灰白色、表面突起、直径0.5mm～0.7mm的细小菌落，菌落透明或半透明，表面光滑有乳光；镜检为革兰氏阳性无芽孢球菌，圆形或卵圆形，呈链状排列，受培养与操作条件影响，链的长度在4个～8个细胞至几十个细胞之间；菌落周围有明显的2mm～4mm界限分明、完全透明的无色溶血环。符合上述特征的菌落为β-溶血性链球菌。
3）结果报告：采样点β-溶血性链球菌结果计算：菌落计数，记录结果并按稀释比与采气体积换算成 CFU/m3(每立方米空气中菌落形成单位)。
嗜肺军团菌的测定
（1）原理
采用液体冲击法采样、培养法定性测定公共场所空气中的嗜肺军团菌。
（2）液体冲击法
1）采样
①采样点：参照撞击法采样布点要求。
②将采样吸收液120mL倒人微生物气溶胶采样器中，然后用吸管加人矿物油1滴～2滴。
③将微生物气溶胶浓缩器与微生物气溶胶采样器连接，按照微生物气溶胶浓缩器和微生物气溶胶采样器的流量要求调整主流量和浓缩流量。
④按浓缩器和采样器说明书操作，每个气溶胶样品采集空气量1m3～2m3。
⑤将采样吸收液220mL倒人微生物气溶胶采样器中，然后用吸管加入矿物油1滴～2滴；在相同采样点重复③、④步骤。
⑥采集的样品不必冷冻，但要避光和防止受热，4h内送实验室检验。
2）检验步骤
①样品的酸处理：对采样后的吸收液1和吸收液2原液各取1mL，分别加入盐酸氯化钾溶液充分混合，调pH至2.2，静置15min。
②样品的接种：在酸处理后的两种样品中分别加入1mol/L氢氧化钾溶液，中和至pH为6.9，各取悬液0.2mL～0.3mL分别接种GVPC平板。
③样品的培养：将接种平板静置于浓度为5%、温度为35℃～37℃的CO2培养箱中，孵育10 d。
④菌落观察：从孵育第3天开始观察菌落。军团菌的菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色；菌落齐，表面光滑，呈典型毛玻璃状，在紫外灯下，部分菌落有荧光。
⑤菌落验证：从平皿上挑取2个可疑菌落，接种BCYE琼脂平板和L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板，35℃～37℃培养2d，凡在BCYE琼脂平板上生长而在L-半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板不生长的则为军团菌菌落。
⑥菌型确定：应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌。生化培养：氧化酶(-/弱+),硝酸盐还原(-),尿素酶(-),明胶液化(+)，水解马尿酸。血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型。
3）结果报告：采样点测定结果：两种采样吸收液中至少有一种吸收液培养出嗜肺军团菌，即为该采样点嗜肺军团菌阳性。一个区域中任意一个采样点嗜肺军团菌阳性，即该区域空气中嗜肺军团菌的测定结果为阳性。
四、实验报告
撰写实验报告，通过对空气中微生物的测定，可以了解环境中微生物的种类、数量及其分布情况，评估空气质量和卫生状况，为环境监测和卫生管理提供参考依据。另外，通过定期对空气中微生物进行监测，有助于及时发现和控制潜在的病原微生物污染，保障人们的健康和安全。